A Princeton egyetem építészhallgatójaként kezdett színészkedni, az amatőr társulat tagja volt Henry Fonda is. Ők ketten 1932-től már a Broadway deszkáit koptatták, Stewart 1935-től játszott nagy szerepeket jelentéktelen filmekben és kicsiket jelentősekben. Sztárrá 1938-ban a Frank Capra rendezte modern erkölcsi példázat, a Becsületből elégtelen tette. Ebben lett az igazság bajnoka, az egyszerű, tétova, lassú beszédű, sőt olykor dadogó, ám becsületes, idealista és az erkölcsi parancsok mellett rendíthetetlenül kitartó "mindenki hőse". A második világháborúig szerepelt westernben, romantikus komédiában, Oscar-díját 1940-ben a Philadelphiai történet főszerepéért kapta. A kitüntetésre még négyszer jelölték és 1985-ben életmű Oscar-díjat vehetett át.

A való életben is igazi hazafi volt: a színészek közül elsőként, még Pearl Harbor bombázása előtt jelentkezett katonai szolgálatra. Először elutasították, mert a szó szoros értelmében könnyűnek találtatott, de végül sikerült alkalmasnak minősíttetnie magát. Pilótaként több mint húsz bombázáson vett részt, ezredesi rangban és érdemrendekkel dúsan dekorálva szerelt le. 1959-ben tartalékos dandártábornokká léptették elő, így ő lett a legmagasabb rangú színész a hadtörténetben.

A háború után keményebb, férfiasabb és kiábrándultabb, ám ugyanolyan szeretetre méltó, becsületes és tehetséges színész tért vissza. Bár a komor és elgondolkodtató Az élet csodaszép 1946-ban megbukott, mára sokak szemében az általa megformált, az élet igazi értékeire ráébredő bankár testesíti meg az átlagamerikait. A negyvenes évek végétől forgatott emlékezetes filmeket a borzongatás nagymesterével, Alfred Hitchcockkal, ilyen volt A kötél, a Hátsó ablak, a Szédülés és Az ember, aki túl sokat tudott. Feltűnt westernekben, komédiákban, s Hollywoodban ő volt az első, aki olyan szerződést, kötött, amely a film bevételeiből biztosított számára részesedést. A hetvenes évek végétől inkább a televízióban szerepelt, élete végét visszavonultan, versek írásával töltötte, 1997. július 2-án bekövetkezett haláláig.

James Stewart magánéletével soha nem adott témát az újságíróknak. "Hollywood legkívánatosabb agglegénye" viszonylag későn, 1949-ben szánta rá magát a nősülésre, s majd fél évszázadot élt feleségével boldogságban.

Színészi tanulmányokat soha nem folytatott, mert úgy vélte, az életből többet lehet tanulni, mint tanároktól vagy könyvekből. Bár nem volt rossz hangja s ritkán fakadt dalra, neve 1965-ben egy country-szám narrátoraként felkerült a slágerlistára is. Szülővárosában szobrot kapott és még életében múzeuma nyílt, s megkapta a legmagasabb polgári kitüntetést. Akármekkora sztár volt is, mindvégig szerény és egyszerű maradt, egyszer azt mondta: "néha azt hiszem, magam is egy James Stewart utánzat vagyok."