Kréta szigetén látta meg a napvilágot, a család hároméves korában költözött Athénba. Nana (Joanaként anyakönyvezték, a Nana családi becenév) gyermekkorát beárnyékolta a német megszállás és a második világháborút követő polgárháború. Tizenkét évesen kezdett énekórákat venni, a rádióban hallott amerikai dzsesszénekesek és a francia sanzonok miatt.

1950-ben felvették az athéni konzervatóriumba, bár ekkor már ismert volt, hogy csak az egyik hangszála aktív - különlegesen tiszta, jellegzetes szopránhangját ennek a rendellenességnek köszönheti. Komolyzenei karrierje gyorsan véget ért: amikor kiderült, hogy egy dzsesszegyüttesben is énekel, kitették a szűrét a zeneiskolából.
Mouskouri nem keseredett el: átnyergelt a könnyedebb műfajokra, és 1958-ban megjelent első kislemeze. Hazájában már sztár volt, amikor 1960-ban Németországban is sláger lett Athén sárga rózsája című dala. A Manosz Hadzidakisz zeneszerző által feldolgozott népdalból több mint egymillió példány kelt el, később számos más nyelvre fordították le és az énekesnő "védjegyévé" vált.

1963-ban Párizsban telepedett le, és már abban az évben ő énekelte - franciául - Luxemburg versenydalát az eurovíziós dalfesztiválon. Michel Legrand neki írta a Cherbourg-i esernyők címadó dalát, és Harry Belafonte személyes kívánsága volt, hogy közösen turnézzanak.

1968-ban önálló estje volt a párizsi Olympia színpadán, 1969-től pedig saját showműsora a brit televízióban. A hetvenes évektől megállás nélkül koncertezett, angol, francia, német, spanyol nyelvű lemezei milliós példányszámban keltek el. Szülőhazájában több mint húsz év után, 1984-ben lépett fel ismét, ettől kezdve már anyanyelvén is készített albumokat.

Mouskouri 1993-tól az UNICEF jószolgálati nagykövete, 1994-1999 között az Európai Parlament görög képviselője volt. Első házasságából két gyermeke született, közel a hetvenhez ment ismét férjhez produceréhez.

Nana Mouskouri az eladott lemezek számát tekintve az egyik legsikeresebb női előadó: 200 millió albumát vették meg, ezzel Celine Dion, Madonna és Mariah Carey mögött a negyedik az "örökranglistán". A jellegzetes szemüvegkeretéről ismert énekesnő repertoárja a klasszikus zenétől a dzsesszig, a popmuzsikától a vallásos és népdalokig terjed. Hét nyelven - görögül, franciául, angolul, németül, spanyolul, olaszul és portugálul - beszél többé-kevésbé folyékonyan, de rögzített dalokat finnül, gaelül, katalánul, héberül, sőt japán és kínai nyelven is.

Több mint 300 arany, platina és gyémántlemezt vehetett át világszerte, Franciaországban 35 CD-ből álló kollekciója jelent meg (a maga nemében ez is világrekord). Pályafutása során 1350 dalt vettek fel vele, utolsó koncertjét tavaly Athénban adta a görög kormányfő, a berlini, a párizsi és a luxembourgi polgármester jelenlétében.