Az ír katolikus bevándorló színészházaspár fiának nehéz gyermekkora volt. Állandóan úton lévő szülei csak néha-néha állapodtak meg, így Eugene-t mindig más iskolába íratták be, ráadásul morfiumfüggőségével megküzdeni képtelen anyja 1902-ben öngyilkosságot kísérelt meg. O'Neill egyetemi tanulmányaival egy év után felhagyott, idejét jobbára New York-i bordélyokban, lokálokban múlatta. 1909-ben megnősült, két év múlva elvált, e házasságából született fia negyven évesen önkezével vetett véget életének. A kudarcba fulladt házasság után matrózként bejárta a világot, a kikötői csavargók életét élte, egyszer egy tömegszálláson kis híján túladagolta magát. Kezdődő tuberkulózisa miatt kellett szanatóriumba vonulnia, ekkor kezdett irodalommal foglalkozni, felgyógyulva a harvardi drámaíró szemináriumhoz csatlakozott.

1918-ban ismét megnősült, de a rövid boldogságot ismét sorscsapások követték: 1921-ben elhunyt édesapja, egy év múlva édesanyja, újabb tizenkét hónappal később testvére halt bele egy súlyos szélütésbe. 1929-ben újra elvált, második házasságából született gyermekeivel kapcsolata gyorsan megromlott. Shane fiától azért fordult el, mert képtelen volt elfogadni annak életvitelét, Oona nevű lányától pedig azért, mert 18 évesen feleségül ment az akkor már középkorú Charlie Chaplinhez. Az író még 1929-ben harmadszor is megházasodott, ezúttal Carlotta Montere színésznőt vezette az oltár elé.

O'Neill első egész estét betöltő drámája, az 1920-ban bemutatott Túl a látóhatáron rögtön elnyerte a Pulitzer-díjat. Gyors egymásutánban születő műveit a kísérletezés, az újszerű megoldások keresése jellemezte; az expresszionista, modernista törekvéseket harmonikusan össze tudta egyeztetni a műfaj hagyományaival. Első nagy tragédiája, a Vágy a szilfák alatt (1924) apák és fiúk vérfertőzéssel és csecsemőgyilkossággal terhelt kapcsolatának klasszikus ókori témáját mutatja be XIX. századi amerikai "köntösben". Különösen jelentős, életművéből kiemelkedik a szintén ókori témát feldolgozó, az amerikai polgárháború után játszódó darabja az Amerikai Elektra (1929-1931). Bár a kritikusok egy része értetlenül állt kísérletező darabjai előtt, a harmincas években O'Neillt már a modern amerikai drámairodalom és színház mestereként ünnepelték, s 1936-ban Nobel-díjjal jutalmazták munkásságát.

Ekkor azonban már egy Parkinson-kórhoz hasonló betegséggel küzdött, a díjat sem vehette át személyesen, később pedig teljesen megrokkant. Élete alkonyán írt drámáit szinte kivétel nélkül pesszimizmus és keserűség hatja át, Hosszú út az éjszakába (1939-1941) című művében vigasztalan és fájdalmas képet rajzol saját családjáról. Utolsó éveiben az alkotni már képtelen, elkeseredett és reményvesztett író egy bostoni szállodában várta a halált, csak harmadik feleségével, orvosával és egy nővérrel érintkezett. Eugene O'Neill 1953. november 27-én hunyt el, épp olyan megtörten és tragikusan, mint amilyennek színpadi karaktereit láttatta.